RNA-Sequenzierung der nächsten Generation

RNA-Sequenzierung (oft auch als RNA-Seq abgekürzt) ist ein Verfahren, das die Technologie der Nächsten Generation Sequenzierung (NGS) nutzt, um die Anzahl und Sequenzen von RNA-Molekülen in einer biologischen Probe zu quantifizieren und zu katalogisieren. Durch die Sequenzierung der RNA einer Zelle werden Einblicke in das Transkriptom der Zelle möglich, das alle RNA-Moleküle umfasst, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle vorhanden sind.

Das Besondere an der RNA-Sequenzierung ist, dass sie nicht nur die Struktur und Menge der RNA in einer Probe bestimmt, sondern auch Veränderungen in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen und/oder zu verschiedenen Zeitpunkten aufzeigen kann. Weiterhin können mittels spezieller Verfahren auch transkriptive Veränderungen auf zellulärer Ebene erfolgen. Damit ergeben sich neue Aspekte in der biologischen Forschung und der medizinischen Diagnostik. Im Gegensatz zu älteren Methoden wie der DNA-Sequenzierung, die das gesamte Genom einer Zelle betrachtet, fokussiert die RNA-Sequenzierung auf die aktiven Teile des Genoms. Diese aktiven Teile sind diejeningen, die in RNA umgeschrieben (transkribiert) werden und die letztlich die Proteine produzieren, die für die Funktion 0der Dysfunktion der Zelle bedeutsam sind.

Vor allem zwei Techniken haben sich als besonders wertvoll erwiesen:

• die allgemeine RNA-Sequenzierungstechnik und
• die Einzelzell-RNA-Sequenzierung.

Die RNA-Sequenzierung: Die RNA-Sequenzierung ist ein komplexer Prozess, der in mehrere Schritte unterteilt ist. Jeder Schritt spielt eine entscheidende Rolle im Gesamtablauf. Grob orientierend lassen sich drei Hauptphasen unterscheiden: die Vorbereitung der RNA-Probe, das Sequenzierungsverfahren selbst und die Datenanalyse.

In der ersten Phase wird die RNA isoliert und für die Sequenzierung vorbereitet. Anschließend folgt die Sequenzierung, bei der die RNA-Sequenzen erfasst werden. Schließlich werden diese Daten analysiert, um die Genexpression, d.h. die Aktivität bestimmter Gene zu verschiedenen Zeitpunkten oder unter verschiedenen Bedingungen zu bestimmen.

• Probenvorbereitung: Zu Beginn wird die RNA aus der Probe isoliert. Dabei werden oft Methoden eingesetzt, die sicherstellen, dass nur hochqualitative und intakte RNA-Moleküle für die Sequenzierung verwendet werden. Die Qualität der RNA ist entscheidend für zuverlässige Ergebnisse.
• Library Preparation: Die isolierte RNA wird dann in eine sogenannte cDNA-Bibliothek eingestellt. Das Erstellen einer cDNA-Bibliothek ist ein notwendiger Schritt, da die meisten Sequenzierungsplattformen DNA und nicht RNA sequenzieren.
• Sequenzierung: Nachdem die cDNA-Bibliothek erstellt wurde, folgt die eigentliche Sequenzierung. Technologien der nächsten Generation (NGS) ermöglichen die parallele Sequenzierung von Millionen von DNA-Fragmenten. Die resultierenden Sequenzen - sogenannte Reads - werden dann mithilfe von Software rekonstruiert, um die RNA-Sequenzen darzustellen.
• Datenanalyse: Die generierten Daten werden im Anschluss analysiert. Dabei werden die Reads den Referenzgenomen oder Transkriptomen zugeordnet, um festzustellen, welche Gene exprimiert werden und in welchem Ausmaß. Diese Daten erlauben es Forschenden, Muster der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen.

Die Einzelzell RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq): Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglicht die Untersuchung der Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen. Diese Technik erlaubt eine Analyse der Heterogenität innerhalb von Zellpopulationen, die in Gewebeproben, auch in scheinbar homogenen Zellkulturen existiert. Bei der Einzelzell-RNA-Sequenzierung werden einzelne Zellen isoliert, ihre RNA extrahiert, in cDNA umgewandelt und sequenziert. Die resultierenden Daten bieten detaillierte Einblicke in den zellulären Zustand und die Aktivität einzelner Zellen, und erlauben eine präzise Analyse der zellulären Diversität und Funktion.

• Eine beispielhafte Anwendung der Einzelzell-RNA-Sequenzierung dürfte in der Krebsforschung liegen, um Unterschiede in der Genexpression zwischen Krebszellen und normalen Zellen innerhalb eines Tumors zu untersuchen. Durch diese Analyse können potenziell therapeutische Ziele entdeckt werden, die spezifisch auf Krebszellen abzielen, während normale Zellen unberührt bleiben.

• Besonders hervorzuheben sind die Analyse von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung maßgeschneiderter Therapien.

• Einflüsse der Umwelt: Die Technologie ermöglicht auch die Untersuchung von Umweltanpassungen bei Pflanzen und Tieren, was für die Erhaltung der Artenvielfalt und die Entwicklung nachhaltiger landwirtschaftlicher Praktiken von großer Bedeutung ist.

• Embryologie: Ein weiteres Einsatzgebiet der Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist die Untersuchung der Entwicklung von Organismen auf Zellebene. Durch die Analyse der Genexpression in Einzelzellen während der Embryonalentwicklung können Forschende detaillierte Entwicklungswege kartieren und die Rolle spezifischer Gene in diesen Prozessen aufklären.

• Atopische Dermatitis und Psoriais: In der Dermatologie können die verschiedenen krankheitsverursachende Zelltypen und -subtypen, die zu den Kennzeichen z.B. der Entzündungssignaturen vom Typ 2 und Typ 3 beitragen und mit Krankheitsaktivitäten assoziiert sind, durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung und TCR-Sequenzierung identifiziert werden (Zhang B et al. 2023). Damit ergeben sich differenzialdioagnostische wichtig Informationen.  

• Mikrobiologie: Die RNA-Sequenzierung ermöglicht Untersuchungen von Bakterien und Hefen, um deren Stoffwechselwege und Resistenzmechanismen gegen Antibiotika zu erforschen.

Die praktischen Anwendungsmöglichkeiten der RNA-Sequenzierung sind bisher schon beeindruckend vielfältig und reichen von der Entdeckung neuer Medikamente über die Verbesserung von Agrartechnologien bis hin zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten. 

Die RNA-Sequenzierung, eine Schlüsseltechnologie in der modernen Genomforschung, hat das Verständnis von Genexpression und zellulären Funktionen revolutioniert. Sie bietet einzigartige Einblicke in das komplexe System der genetischen Regulation. Vor allem zwei Techniken haben sich als besonders wertvoll erwiesen:

• die allgemeine RNA-Sequenzierungstechnik und
• die Einzelzell-RNA-Sequenzierung.

Die Standardtechnik der RNA-Sequenzierung ermöglicht es, die Transkriptome von Zellen oder Gewebeproben umfassend zu analysieren. Diese Methode liefert Informationen darüber, welche Gene in den Proben zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv sind und wie stark sie exprimiert werden. Der Prozess umfasst umfassend die Extraktion der gesamten RNA aus der Probe, die Umwandlung dieser RNA in cDNA (komplementäre DNA) und die anschließende Sequenzierung der cDNA mit einer Hochdurchsatzsequenzierungsplattform (Die cDNA ist einfacher zu sequenzieren als RNA und stabiler, was zu präziseren Ergebnissen führt). Die daraus resultierenden Daten geben Aufschluss über die Genexpression und helfen dabei, biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen zu verstehen.

Beispielhaft könnte die RNA-Sequenzierungstechnik genutzt werden, um zu untersuchen, wie die Genexpression in menschlichen Leberzellen auf eine bestimmte Behandlung mit einem neuen Medikament reagiert. Durch die Analyse der Veränderungen in der Genexpression können die forschenden potenziellen Zielgene für weitere therapeutische Interventionen identifiziert werden.

Neben der Identifizierung exprimierter Gene ermöglicht die RNA-Sequenzierung auch die Entdeckung von neuen Genen, die in früheren Untersuchungen möglicherweise übersehen wurden, sowie von alternativen Spleißvarianten existierender Gene. Diese Informationen erweitern unser Verständnis der genomischen Komplexität und der funktionalen Diversität innerhalb von Zellen.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung : Während die allgemeine RNA-Sequenzierungstechnik Einblicke in die durchschnittliche Genexpression innerhalb einer Probe liefert, ermöglicht die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) die Untersuchung der Genexpression auf der einzelnen Ebene Zellen. Damit gelingt es die Heterogenität innerhalb von Zellpopulationen zu analysieren, die in Gewebeproben, auch in scheinbar homogenen Zellkulturen, existiert. Bei der Einzelzell-RNA-Sequenzierung werden einzelne Zellen isoliert, ihre RNA in cDNA umgewandelt und sequenziert. Die resultierenden Daten bieten detaillierte Einblicke in den zellulären Zustand und den jeweiligen Aktivierungszustand einzelner Zellen und ermöglichen eine präzise Analyse der zellulären Diversität und Funktion.

Krebsforschung: Eine beispielhafte Anwendung der Einzelzell-RNA-Sequenzierung könnte in der Krebsforschung liegen, wo Wissenschaftler die Technik verwenden, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen Krebszellen und normalen Zellen innerhalb eines Tumors zu untersuchen. Durch diese Analyse können potenzielle therapeutische Ziele entdeckt werden, die spezifisch auf Krebszellen abzielen, während normale Zellen unberührt bleiben.

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