RNA-Sequenzierung

RNA-Sequenzierung (kurz: RNA-Seq) ist ein molekularbiologisches Verfahren, mit dem man bestimmen kann:

• welche Gene in einer Zelle oder einem Gewebe aktiv sind
• wie stark diese Gene exprimiert werden
• welche RNA-Varianten (Isoformen, Mutationen) vorhanden sind.

Die RNA-Sequenzierung macht das Transkriptom sichtbar (unter Transkriptom versteht man die Gesamtheit aller RNA-Moleküle, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle vorhanden sind).

Die DNA enthält die genetische Information einer Zelle. Jedoch wird zu einem bestimmten Zeitpunkt nur ein Teil der Gene abgelesen und in RNA umgeschrieben (dies ist ein Maß für die aktuelle Genaktivität). Die RNA-Sequenzierung misst also nicht das „Potenzial“ (DNA), sondern die tatsächliche Genaktivität, d.h. mit welcher Frequenz zu einem bestimmten Zeitpunkt die DNA transkribiert wird. Der typische Ablauf der RNA-Sequenzierung erfolgt in mehreren Schritten.

RNA-Isolation: Aus einer Probe (z.B. Blut, Hautbiopsie, Tesafilmabriss mit genetischem Material, Tumorgewebe) wird die gesamte RNA isoliert. Diese enthält

• mRNA (kodierende RNA)
• rRNA
• tRNA
• lncRNA, miRNA usw.

Im Allgemeinen interessiert man sich vor allem für mRNA, weil sie die Aktivität von Genen widerspiegelt.

Transkrkiption in eine cDNA: In einem nächsten Schritt wird die mRNA in ein cDNA transkriptiert. Der GRund für diesen Zwischenschritt: Die mRNA ist instabil. Insofern kann sie nicht gut direkt sequenziert werden. Insofern wird sie mittels reverser Transkription in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben. Das ist der gleiche Prozess wie bei der RT-PCR (Reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction).

Library-Herstellung: Die cDNA wird fragmentiert, mit speziellen Adapter-Sequenzen versehen und vervielfältigt. So entsteht eine sogenannte Sequenzier-Bibliothek.

Sequenzierung (z.B. Illumina^®): Die cDNA-Fragmente werden in einem nächsten Schritt in Hochdurchsatz-Sequenziergeräten gelesen. Hierbei geht es um Millionen kurzer Sequenzen („Reads“). Eine leistungsfähige Nachweis-Plattform, die diese Mengen an Reads verarbeiten kann, ist z.B. das Illumina NovaSeq -System

Bioinformatische Auswertung: In dem digitalen Verarbeitungsprozess werden die analysierten Reads mit dem Referenzgenom verglichen. Die analysierten DNA-Reads können nun bestimmten Genen zugeordnet und gezählt werden. Das Ergebnis lässt eine Aussage zu folgenden Frage zu:

• Welche Gene sind hochreguliert?
• Welche sind herunterreguliert?
• Welche Signalwege sind aktiv?

Unterschied zu Microarrays: Früher nutzte man vor allem Microarrays. Das RNA-Seq ist überlegen, da in einem Analysesauftrag, bei extrem schnellem Umsatz die Untersuchung aller Gene möglich ist.   

Anwendungen

In der Medizin:

• Tumorprofilierung
• Entzündungsprozesse mit dem Ziel einer personalisierten Medizin  und der Etablierung einer Präzisionsmedizin
• Analyse von Immunantworten
• Biomarker-Suche
• Auswirkungen von Medikamenten auf die Aktivität bestimmter Gene

In der Forschung:

• Der molekulare Vergleich krank vs. gesund
• Entwicklungsbiologie
• Zelltypen charakterisieren
• Entdeckung neuer bisher unbekannter Transkripte