Nanopore Sequencing

Nanopore Sequencing ist eine moderne DNA-Sequenzierungstechnologie der „dritten Generation“, die sich grundlegend von Illumina- oder anderen NGS-Methoden unterscheidet. Die Methode ermöglicht das direkte Ablesen einzelner DNA- oder RNA-Moleküle in Echtzeit, ohne vorherige Amplifikation (Vervielfältigung). Entwickelt wurde sie hauptsächlich von der Firma Oxford Nanopore Technologies (ONT).

Grundprinzip von Nanopore Sequencing: Bei dieser Methode wird eine Einzelstrang-DNA oder -RNA durch eine winzige Nanopore (eine biologische oder synthetische „Molekülöffnung“) in einer Membran geführt. Während das Molekül hindurchwandert, verändert es den Ionenstrom, der durch die Pore fließt. Diese Stromänderungen sind charakteristisch für jede Base (A, T, C, G) und können elektronisch gemessen werden.

1. Probenvorbereitung: Die DNA oder RNA wird mit einem Motorenzym verbunden, das das Molekül kontrolliert durch die Pore zieht. Anders als bei Illumina-Sequencing sind keine aufwendigen Amplifikations- oder Markierungsschritte nötig.

2.Durchgang durch die Nanopore: Die Nanopore befindet sich in einer elektrisch leitenden Membran. Eine Spannung wird angelegt, und Ionen fließen durch die Pore, was einen elektrischen Strom erzeugt. Wenn DNA oder RNA durch die Pore gleitet, stören die Basen den Strom unterschiedlich stark.  Jedes Basenmotiv (z. B. 5-Mer) erzeugt ein einzigartiges Stromsignal.

3. Signalmessung und Base Calling: Der Strom wird kontinuierlich gemessen. Eine Software wandelt die Strommuster in Basensequenzen (A, T, C, G) um. Dieser Vorgang findet kin Echtzeit statt – man kann die Sequenz „live“ sehen, während sie gelesen wird.

Rasche Fortschritte in der Nanoporentechnologie zur Sequenzierung einzelner langer DNA- und RNA-Moleküle haben zu erheblichen Verbesserungen bei Genauigkeit, Leselänge und Durchsatz geführt. Diese Durchbrüche erforderten eine umfassende Entwicklung experimenteller und bioinformatischer Methoden, um die langen Leselängen von Nanoporen für die Untersuchung von Genomen, Transkriptomen, Epigenomen und Epitranskriptomen voll auszuschöpfen (McCormick CA et al. 2024).

Die Analyse der Rohdaten der Nanoporen-Signale bietet jedoch weitaus mehr Möglichkeiten als die bloße Sequenzierung von Genomen und Transkriptomen: Algorithmen, die mithilfe maschineller Lernverfahren biologische Informationen aus diesen Signalen extrahieren, ermöglichen die Erkennung von DNA- und RNA-Modifikationen, die Schätzung der Poly(A)-Schwanzlänge und die Vorhersage von RNA-Sekundärstrukturen (Wan YK et al. 2022).

Bei der bakteriellen Genexpression bietet die Nanopore Direct RNA Sequencing (DRS) eine vielversprechende Plattform für die schnelle und umfassende Charakterisierung der bakteriellen RNA-Biologie. Unter Verwendung unveränderter in vitro transkribierter (IVT) RNA-Bibliotheken als Negativkontrolle lassen sich mehrere Nanopore-basierte Computertools mutmaßliche Modifikationsstellen in den Transkriptomen von E. coli und S. aureus identifizieren. In Kombination mit Next-Generation-Sequencing-basierten N6-Methyladenosin (m6A)-Nachweismethoden wurden 75 hochzuverlässige m6A-Kandidaten in den proteinkodierenden Transkripten von E. coli identifiziert, während in S. aureus keine nachgewiesen wurden. Damit wird das Potenzial von Nanopore DRS für die systematische und komfortable Transkriptom- und Epitranskriptomanalyse offengelegt (Tan L et al. 2024).

1. Hong A et al. (2022) Analyzing viral epitranscriptomes using nanopore direct RNA sequencing. J Microbiol 60:867-876.
2. McCormick CA et al. (2024) Multicellular, IVT-derived, unmodified human transcriptome for nanopore-direct RNA analysis. bioRxiv 28:2023.04.06.535889.
3. Tan L et al. (2024) Analysis of bacterial transcriptome and epitranscriptome using nanopore direct RNA sequencing. Nucleic Acids Res 52:8746-8762.
4. Wang Y et al. (2021) Nanopore-Sequenzierungstechnologie, Bioinformatik und Anwendungen. Nat Biotechnol 39:1348-1365.
5. Wan YK et al. (2022) Beyond sequencing: machine learning algorithms extract biology hidden in Nanopore signal data. Trends Genet 38:246-257.