cDNA

cDNA ist das Akronym für „complementary DNA“  oder komplementäre DNA. Hierbei handelt es sich um eine künstlich hergestellte DNA, die in einem molekularbiologischen Labor aus mRNA (Messenger RNA) erzeugt wird. cDNA ist somit die DNA-Kopie eines aktiven Gens. Sie wird aus mRNA (Messanger-RNA) erzeugt, enthält nur Exons, ist stabil und wird in Forschung, Diagnostik und Molekularbiologie ständig verwendet.

Die Reverse Transkription von RNA, gekoppelt mit der Amplifikation der resultierenden cDNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), ist eine der wichtigsten molekularbiologischen Technologien der Gegenwart und findet Anwendung in allen Bereichen von Wissenschaft und Medizin (Bustin SA et al. 2022).

Der technische Ablauf:

1. In einer Zelle wird  zunächst ein Gen in eine mRNA transkribiert.
2. Diese mRNA enthält nur die genetische Information des exprimierten Gens (also ohne Introns).
3. In einem weiteren Schritt wird die küsnltich erstellte mRNA mithilfe des Enzyms „Reverse Transkriptase“ in eine DNA „zurückübersetzt“.
4. Das Ergebnis ist eine einzelsträngige DNA – die cDNA.
5. Meist wird daraus anschließend eine doppelsträngige cDNA erzeugt.

Wichtig: Die mRNA ist das Molekül in einer Zelle, das anzeigt, welches Gen zu dem Untersuchungszeitpunkt aktiv (auch das Ausmaß der Aktivität kann bestimmt werden) ist. 

Einige wichtige Details unterscheidet eine cDNA von einer genomischen (normalen )DNA. Insbesondere fehlen ihr die Introns (nicht kodierende Abschnitte). Introns wurden bereits bei der mRNA herausgeschnitten. Da die cDNA spiegelbildlich identisch mit der mRNA ist, enthält die cDNA ebenfalls nur die kodierenden Bereiche (Exons) eines Gens. Dies ist einer der technischen Hauptgründe warum ein Gen ohne Introns leichter zu klonen oder hinsichtlich seiner Aktivitäten einfacher gemessen werden kann.

Eine cDNA wird schwerpunktmäßige wie folgt verwendet:

• Genexpressionsanalyse: Methodologisch wird hierzu z. B. das qPCR-Nachweisverfahren eingesetzt, das in Echtzeit- und fluoreszenzbasiert (RT-qPCR) analysiert welche Gene aktiv sind, und wie die Stärke ihrer Aktivität zu bemessen ist. Die Genexpressionsanalyse wird seit Langem als Kerntechnologie für die präzise, schnelle und sensitive Labordiagnostik von Infektionskrankheiten oder in der Tumor- und Mutationsdiagnostik) eingesetzt (Bustin SA et al. 2022). Das zentrale Ergebnis einer qPCR ist hierbei der Ct-Wert (cylce threshold), der darüber Auskunft gibt, nach wie vielen PCR-Zyklen die Fluoreszenz die Nachweisgrenze überschreitet (niedriger Wert= umfangreiches Ausgangsmaterial).   
• Herstellung von cDNA-Bibliotheken. Die Erstellung von cDNA-Bibliotheken in voller Länge ermöglicht es Forschern, Genexpression und Proteininteraktionen zu untersuchen und neue Gene zu entdecken. Die Techniken erlauben inzwischen die Herstellung hochwertiger cDNA-Bibliotheken mit geringen mRNA-Mengen. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Erstellung hochwertiger cDNA-Bibliotheken ist die „Normalisierung“. Die Unterschiede in der Genexpression können mehrere Größenordnungen betragen. Daher ist die Normalisierung der cDNA-Bibliothek unerlässlich. Mit dem Enzym „Duplexspezifischen Nuklease“, ist es möglich, die cDNA-Bibliothek zu normalisieren, basierend auf der Tatsache, dass häufiger vorkommende Moleküle nach der Denaturierung eher wieder zusammenlagern als seltene Moleküle (Kooiker M et al. 2014).
• Klonieren von Genen, insbesondere eukaryotischer Gene ohne Introns
• RNA-Sequenzierungs-Auswertung
• Diagnostische Tests, bei denen nur die exprimierten Gene von Interesse sind.

1. Bogdanova EA et al. (2008) Normalization of full-length enriched cDNA. Mol Biosyst 4: 205-212.
2. Bustin SA et al. (2022) RT-qPCR Detection of SARS-CoV-2: No Need for a Dedicated Reverse Transcription Step. Int J Mol Sci 23:1303.
3. Kooiker M et al. (2014) cDNA library preparation. Methods Mol Biol1099:29-40.