Illumina-Sequencing

Illumina Sequencing (auch bekannt als Sequencing by Synthesis, SBS) ist eine weitverbreitete Next-Generation Sequencing (NGS)-Technologie, die DNA- oder RNA-Sequenzen schnell, präzise und kosteneffizient bestimmen kann. Sie wird von der Firma Illumina Inc. entwickelt und ist heute eine der Standardmethoden in der Genomforschung, Medizin und Biotechnologie.

1. Probenvorbereitung (Library Preparation). Die DNA oder RNA wird zunächst:

• in viele kleine Fragmente zerlegt

• an deren Enden werden Adapter-Sequenzen angehängt (synthetische kurze DNA-Stücke, die später für die Bindung an den Chip und das Sequenzieren gebraucht werden).

2. Anlagerung auf dem Flow Cell: Die DNA-Fragmente mit ihren Adaptern werden auf eine Glasoberfläche gebracht, die sogenannte Flow Cell. Auf der Flow Cell befinden sich komplementäre Oligonukleotide, die an die Adapter binden.

3. Cluster-Generierung (Bridge Amplification): Jedes einzelne DNA-Fragment wird in situ (direkt auf der Flow Cell) vervielfältigt, sodass Tausende identische Kopien an einem Ort entstehen – ein sogenannter Cluster. Dieser Schritt  ist wichtig, um das Signal beim Sequenzieren ausreichend zu vertstärkken.

4. Sequencing by Synthesis (SBS): Hierbei passiert der eigentliche Lesevorgang:

• Eine DNA-Polymerase fügt komplementäre Basen (A, T, C, G) an den wachsenden Strang an.

• Jede Base ist mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert – jede Base in einer anderen Farbe.

• Nach jedem Einbau wird ein Foto gemacht, das festhält, welche Base eingebaut wurde.

• Dann wird der Farbstoff chemisch entfernt, und der nächste Zyklus beginnt. Dieser Vorgang passiert millionenfach parallel – jeder Cluster liefert eine Sequenz.

5. Datenauswertung (Base Calling & Alignment)

Die vielen fluoreszierenden Signale werden in digitale Daten übersetzt (A, T, C, G).

Die resultierenden Reads (typischerweise 50–300 Basen lang) werden dann:

• qualitätsgeprüft,

• zusammengesetzt (z. B. zu einem Genom oder Transkriptom),

• und mit Referenzsequenzen verglichen.

Vorteile von Illumina Sequencing

• Hohe Genauigkeit (Fehlerrate < 0,1 %)
• Hoher Durchsatz (Milliarden Basen pro Lauf)
• Geringe Kosten pro Base
• Gut standardisiert und weit verbreitet

Nachteile

• Relativ kurze Reads (bis ~600 bp mit paired-end sequencing)
• Aufwendige Datenanalyse
• Geräte und Reagenzien sind teuer