Whole-genome bisulfite sequencing

Die Epigenetik hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einer schnell wachsenden und technologisch vielfältigen Disziplin entwickelt. Darüber hinaus hat die Einführung massiv paralleler Next-Generation-Sequencing-Verfahren (NGS) in den frühen 2000er Jahren die Zugänglichkeit und Effizienz der Methode dramatisch erhöht, was die Entwicklung von Bisulfit-basierten Technologien vorangetrieben hat. Fortschritte in der Bisulfit-Sequenzierung haben die Methylierungsforschung von ausgewählten Regionen auf die Bisulfit-Sequenzierung des gesamten Genoms (WGBS) ausgeweitet (Stevens M et al. 2013). In jüngster Zeit haben neuartige Sequenzierungsprotokolle wie die oxidative Bisulfit-Konvertierung (TruMethyl oxBS), die enzymbasierte Konvertierung (EM-seq) und die zielangereicherungsbasierte Bisulfit-Konvertierung (Illumina EPIC Capture)  die Methylierungsforschung weiter vorangetrieben (Gong T et al. 2022).

Die Whole-genome bisulfite sequencing (Bisulfit-Sequenzierung des gesamten Genoms/WGBS) besteht aus drei Schritten: Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Alignment sowie Qualitätskontrolle. Der grundlegende Schritt ist die Bibliotheksvorbereitung, bei der die Bisulfit-Umwandlungsreaktion von unmethyliertem Cytosin zu Uracil stattfindet. Die behandelte DNA wird dann mithilfe einer NGS-Plattform sequenziert, um zahlreiche kurze „Reads“ zu erzeugen. Der letzte Schritt umfasst die Verarbeitung der Roh-Reads mit verschiedenen bioinformatischen Methoden, um Daten von schlechter Qualität zu entfernen, sowie die nachgelagerte Analyse zur Erforschung der biologischen Prozesse. Diese Methode stellt derzeit den Goldstandard für die Bewertung der DNA-Methylierung dar.

DMRs: Die Erkennung differentieller Methylierungsregionen (DMR-Erkennung) ist eine der wichtigsten Methylierungsanalysen in der Praxis und umfasst die Analyse genomischer Regionen in mehreren Proben. Die häufigste Anwendung besteht darin, abnormale Methylierungsregionen zwischen pathologischen Proben- und Normalproben zu finden, die als Biomarker dienen oder Aufschluss über die Biologie der Krankheit geben können. Die Implementierungsansätze auf der Grundlage des statistischen DMR-Rahmens variieren zwischen  versch. Softwareprogrammen.

Z.B. verwendet BSmooth einen lokalen Wahrscheinlichkeitsglättungsansatz, um DMRs in einer probenspezifischen Methylierungsbestimmung zu identifizieren (Hansen KD et al. 2012). Es wendet den Welch-t-Test an, eine Anpassung des Student-t-Tests zum Vergleich mehrerer Proben.

1. Doskocil J et al. (1962) Distribution of 5-methylcytosine in pyrimidine sequences of deoxyribonucleic acids. Biochim Biophys Acta 55:953–959.
2. Ehrlich M et al. (1981) 5-Methylcytosine in eukaryotic DANN. Science 212:1350–1357.
3. Gibson F et al. (2022) Epigenetic Dysregulation in Autoimmune and Inflammatory Skin Diseases. Clin Rev Allergy Immunol 63:447-471.
4. Gong T et al. (2022) Analysis and Performance Assessment of the Whole Genome Bisulfite Sequencing Data Workflow: Currently Available Tools and a Practical Guide to Advance DNA Methylation Studies. Small Methods 6:e2101251.
5. Greenberg MVC et al. (2019) The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease, Nat Rev Mol Cell Biol 20:590–607.
6. Grönniger E et al. (2024) Skin Rejuvenation by Modulation of DNA Methylation. Exp Dermatol 33:e70005.
7. Hansen KD et al. (2012) BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions, Genome Biol 13:R83.
8. Mervis JS et al. (2020) DNA methylation and inflammatory skin diseases. Arch Dermatol Res 312:461-466.
9. Stevens M et al. (2013) Estimating absolute methylation levels at single-CpG resolution from methylation enrichment and restriction enzyme sequencing methods, Genome Res 23:1541–1553.
10. Younesian S et al. (2022) The DNA Methylation in Neurological Diseases. Cells 11:3439.